Kit di Atpmetria di prima e seconda generazione
Limitazioni dei kit Atp-metria di prima e seconda generazione
Discriminare tra lievito e ATP batterico è una sfida.
Kit ATP di quarta generazione: discriminare il lievito dai batteri.
- Per essere affidabili, i metodi rapidi per l’analisi della bioluminescenza dell’Atp devono essere in grado di superare diverse sfide tecniche.
Per comprendere le sfide affrontate dai kit convenzionali per il dosaggio dell’ATP, è necessario capire come funzionano i diversi tipi di kit per il dosaggio della bioluminescenza dell’ATP.
I metodi convenzionali di dosaggio della bioluminescenza dell’ATP disponibili sul mercato si dividono in due categorie,
- Kit di ATP-metria di prima generazione
- Kit di ATP-metria di seconda generazione
Ognuna di queste categorie di test di bioluminescenza Atp ha i propri limiti.
Ma prima guardiamo la differenza tra questi due tipi di kit di test di bioluminescenza ATP, per capire le sfide.
I classico kit di ATP-metria di prima e seconda generazione.
I kit di Atpmetria di prima generazione si riferiscono al metodo di analisi in bioluminescenza dell’Atp totale in cui tutte le molecole di Atp libere e quelle intracellulari vengono analizzate insieme senza alcuna discriminazione.
I kit di dosaggio dell’ATP di seconda generazione si riferiscono a metodi di analisi della bioluminescenza dell’ATP che quantificano solo l’ATP intracellulare, senza alcuna discriminazione del tipo di cellula, sia essa vegetale, somatica o microorganismo.
Teoricamente, maggiore è la quantità di ATP rilasciata, maggiore è l’intensità della bioluminescenza ATP in presenza di luciferina-luciferasi, maggiore è il numero di microrganismi vitali nel campione.
Ma la presenza di sostanze inibitrici e di ATP libero distorce il quadro.
Prima di esaminare i problemi tecnici che i kit Atpmetry di prima e seconda generazione non risolvono, è utile capire l’impatto delle diverse molecole e cellule nei campioni sulla bioluminescenza dell’Atp misurata.
Quali molecole e cellule nel campione influenzano la bioluminescenza dell’Atp?
I metodi convenzionali per misurare la bioluminescenza dell’ATP (adenosina trifosfato) hanno molti problemi tecnici irrisolti. Questo rende i risultati dei loro kit di ATPmetria inaffidabili. Vediamo perché.
Le sfide irrisolte dei kit di Atpmetria di prima e seconda generazione…
Sottintesi inibitorie responsabili dei falsi negativi.
L’Atp libero innesca falsi positivi.
Molte molecole presenti nelle bevande, e in altri liquidi, se non eliminate (anidride solforosa, ioni metallici, tannini, polifenoli) inibiscono la reazione di bioluminescenza dell’ATP come pubblicato in studi scientifici.
Il tampone raccoglie tracce di detergenti sulla superficie che vengono poi rilasciate con l’estrattore nella provetta di analisi del luminometro che contiene luciferina-luciferasi.
Queste sostanze inibitrici ridurranno quindi la reazione di bioluminescenza innescata dalla presenza di luciferina-luciferasi con l’ATP recuperato.
Quindi i valori di luminescenza rilevati dal bioluminometro saranno più bassi di quanto dovrebbero essere, a causa di questo effetto inibitorio e daranno risultati falsi negativi.
Questi falsi negativi porteranno l’utente a credere che la popolazione microbica nel campione sia bassa o inesistente, quando in realtà è vero il contrario!
Alcune bevande e in particolare la birra possono contenere molto ATP libero di origine vegetale rilasciato durante la produzione di birra da cellule vegetali lisate.
D’altra parte, quando i lieviti si moltiplicano, gemmano e producono cellule figlie. Queste cellule figlie si staccano dalla cellula madre e rilasciano enormi quantità di ATP in questo momento cruciale.
Se questo ATP libero non viene distrutto o rimosso, viene analizzato insieme all’ATP dei microrganismi e dà risultati falsamente positivi.
Questi falsi positivi suggeriscono che il campione analizzato contiene molti microrganismi, mentre i valori di bioluminescenza sono dovuti principalmente all’ATP libero…
Esiste una correlazione tra ATP e concentrazione di microrganismi vitali?
Teoricamente, maggiore è la quantità di ATP rilasciata, maggiore è l’intensità della bioluminescenza ATP in presenza di luciferina-luciferasi, maggiore è il numero di microrganismi vitali nel campione.
Ma la presenza di sostanze inibitrici e di ATP libero distorce il quadro.
L’Atpmetria di prima o seconda generazione non è specifica
In una miscela di cellule di origine diversa, i metodi convenzionali di misurazione della bioluminescenza dell’Atp, sia di prima che di seconda generazione, non riescono a discriminare l’Atp microbico dall’ATP di altre cellule vegetali o somatiche, per esempio nel campionamento di superficie.
I reagenti utilizzati generalmente lisciano tutte le cellule senza discriminazione di tipo cellulare e rilasciano ATP da tutte le cellule. Questo è particolarmente problematico perché alcune cellule non microbiche contengono enormi quantità di ATP e quindi i valori di bioluminescenza da questo Atp non microbico non saranno mai in grado di quantificare la popolazione del microrganismo.
I kit di Atpmetria di terza generazione affrontano queste sfide.
I kit di ATP-metria di terza generazione si riferiscono a un metodo di quantificazione dell’ATP microbico intracellulare discriminato dall’ATP libero e dall’ATP delle cellule somatiche.
Questo tipo di test dell’ATP utilizza una combinazione di una cuvetta con fondo a filtro con un estrattore di ATP per cellule somatiche e un reagente di lisi microbica.
Questo metodo di analisi di bioluminescenza ATP è stato utilizzato con successo e pubblicato in numerosi studi che correlano l’analisi Atpmetry e i risultati delle colture su agar per: acqua potabile, acqua di piscina, fluidi di taglio, spore di bacillo, analisi di superficie, aria e carcasse di carne.
Il kit di test Atp di terza generazione è stato originariamente chiamato Profile-1 e inventato dalla New Horizons Diagnostics Inc. di Baltimora, USA. Il kit è stato usato per la prima volta per rilevare le spore del bacillo negli aerosol biologici durante la guerra Desert Storm in Iraq, e più tardi per i test d’igiene delle carcasse di carne e dell’acqua potabile.
Questo kit concentra le cellule con una siringa e un concentratore di cellule che contiene un filtro rimovibile, il Filtravette™.
Questa invenzione Filtravette™ permette di concentrare, filtrare le sostanze inibitrici e l’ATP libero, l’ATP delle cellule somatiche contenute nel campione, di fare diversi trattamenti del campione e di innescare e quantificare la reazione di bioluminescenza Atp, tutto nella stessa cuvetta.
Il kit di Atpmetria di terza generazione concentra le cellule da analizzare, libera l’Atp somatico, rilascia l’Atp libero e somatico, aggiunge la luciferina-luciferasi e misura la bioluminescenza dell’ATP nello stesso piatto filtro.
Efficace lisciviazione degli inibitori.
Qui, a destra, due grafici mostrano l’efficienza della lisciviazione della Filtravette con il reagente di lisciviazione SRA, campioni liquidi contenenti diverse concentrazioni di un detergente TCA e candeggina e l’impatto sul segnale di bioluminescenza ATP con o senza lisciviazione della Filtravette.
Numerosi studi di correlazione con i kit di Atpmetria di terza generazione.
Il kit Profile-1 di Atpmetria di terza generazione è stato oggetto di numerosi studi scientifici indipendenti grazie alla sua affidabilità e resistenza alle sostanze inibitrici. Questi studi hanno convalidato la correlazione tra i metodi di coltura su agar e i valori di bioluminescenza Atp in un campione misurato con il kit Profile-1.
Seleziona gli studi di correlazione pubblicati in inglese cliccando sui diversi pulsanti qui sotto.
Acqua potabile
Acqua clorata della piscina.
Acqua di balneazione E. Coli
Igiene superficiale delle carcasse di carne.
Analisi microbiologica della carneue de la viande
Aerosol biologici.
Fluidi di taglio.
Controllo di disinfezione.
Tuttavia i kit di test ATP di terza generazione hanno i loro limiti, non discriminano selettivamente i microrganismi per altri microrganismi non mirati.
La sfida dei batteri attaccati al lievito per i kit di Atpmetria di terza generazione.
Un altro ostacolo importante. Il lievito non può essere facilmente separato da tutti i batteri acetici e lattici. Alcuni batteri aderiscono alle cellule di lievito e formano aggregati microbici.
È quindi impossibile con i metodi classici di misurazione dell’ATP, siano essi di prima, seconda o terza generazione, differenziare i batteri dal lievito, quando l’ATP del lievito viene analizzato con l’ATP batterico.
Questa è una delle ragioni per cui l’Atpmetria classica non è utilizzata in enologia, tranne che per i controlli d’igiene. Una singola cellula di lievito contiene tanto ATP quanto 100 cellule batteriche vitali.
D’altra parte, grandi popolazioni di batteri lattici (da 10 potenza 7/ml) possono essere trovate nel vino in maturazione. Questi batteri falsano i risultati se vogliamo conoscere il numero di lieviti vitali.
Questo significa che non c’è soluzione a queste sfide tecniche? Al contrario, una tecnologia ha trovato la soluzione: una rapida ATPmetria selettiva che discrimina tra il lievito e certi batteri.
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