Rapida enumerazione in loco dei Brettanomyces bruxellensis viventi: milioni di euro risparmiati.
Milioni di euro vengono persi ogni anno dai viticoltori a causa del deterioramento dei vini rossi da Brettanomyces bruxellensis. Tuttavia, una tecnologia di rilevamento innovativa, Brett Alert, sta cambiando il gioco. Questa tecnologia veloce in loco può essere utilizzata da tutti i viticoltori e:
- rileva in 30 minuti sul posto in cantina le soglie pre-critiche di Brettanomyces nel vino sul fondo del tino o della botte, discriminate dai Brett morti.
- risolve i falsi negativi dei kit di analisi PCR di Brettanomyces, inibiti da polifenoli e tannini
- risolve i falsi positivi dei kit di analisi PCR per Bretts, innescati da microrganismi morti
- e permette all’enologo di intraprendere azioni correttive immediate in cantina prima di raggiungere soglie critiche e incurabili.
Come funziona il rilevamento rapido di Brettanomyces vitali mediante bioluminescenza selettiva dell' Atp?
Il kit Brett Alert rileva rapidamente i Brettanomyces vitali laddove i Brett sono la principale popolazione di lieviti nelle fecce, dopo la fermentazione alcolica, durante la fermentazione malolattica e durante l’invecchiamento in botte post FML. In contrasto con i lieviti aerobici della vela, che amano stare in superficie vicino al tappo, i Brettanomyces prosperano nelle fecce e sono rari, se non inesistenti, in superficie e al centro della botte o del serbatoio.
Anche se i reagenti del kit Brett Alert non distinguono specificamente i Brettanomyces dagli altri lieviti, analizzano i campioni di vino dal fondo della botte e dal fondo del serbatoio dove i Brett sono la popolazione principale. Questa è una garanzia che la bioluminescenza ATP rilevata con Brett Alert proviene principalmente da Brettanomyces vitali. Brett Alert può quindi essere usato come un efficace strumento di avvertimento per una crescita anomala di lieviti Brettanomyces.
In contrasto con l'analisi PCR dei Brettanomyces, il kit Brett Alert discrimina tra Bretts vivi e morti...
L’ATP intracellulare nel lievito è prodotto solo se il lievito è vivo. La misurazione dell’ATP del lievito è quindi un buon metodo per distinguere tra lievito Brettanomyces vivo e morto.
Più alta è la reazione di bioluminescenza misurata, maggiore è la dimensione e il numero di cellule Brettanomyces vive.
Il kit Brett Alert discrimina tra i veri Brett vitali non coltivabili e i Brett che sono effettivamente morti.
Le cellule vitali non coltivabili di Brettanomyces (VNC) saranno ancora rilevate dalla bioluminescenza Atp o dalla misurazione Atpmetry, anche se diminuiranno di dimensioni. Il kit Brett Alert può essere utilizzato per distinguere le cellule di Brettanomyces vitali e non coltivabili dalle cellule di Brettanomyces veramente morte.
Molto spesso, la PCR sovrastima il numero reale di VNC Bretts perché la PCR non è in grado di discriminare le unità genomiche delle cellule morte da quelle vive.
Un modo molto semplice per testare il kit Brett Alert e la PCR per vedere la loro capacità di distinguere tra Brett vivi e morti è quello di analizzare i Brettanomyces trattati con un’alta concentrazione di anidride solforosa, dove siamo sicuri che i Brettanomyces sono morti, e confrontare i due risultati.
Come funziona il kit Brett Alert?
Il kit Brett Alert utilizza la tecnologia brevettata di bioluminescenza selettiva dell’ATP per estrarre e analizzare l’ATP dal lievito in 30 minuti senza analizzare l’ATP dai batteri del vino, invece di aspettare più di 7 giorni per i risultati della conta su agar.
I campioni di vino analizzati sono presi appena sopra la feccia, dove i Bretts sono in maggioranza quando il vino è invecchiato.
Il Brett Alert utilizza:
il “Brettsampler” per assaggiare il vino in fondo alla botte dove i Bretts sono in maggioranza,
accoppiato con l’analisi selettiva dell’ATP del lievito discriminato dall’ATP batterico nel vino.
Fase 1: prelevare il vino e concentrare i Brettanomyces
Fase 2: Lisciviazione degli inibitori e dell'Atp libero
Brett Alert rimuove la maggior parte dei polifenoli e dei tannini che inibiscono la bioluminescenza dell’ATP, così come l’ATP libero dall’uva o dai microrganismi morti, attraverso un ingegnoso sistema di lisciviazione.
I tannini e gli antociani vengono lisciati attraverso il fondo filtrante di una ciotola, sostanze che vengono poi assorbite per capillarità da una carta assorbente in contatto con il fondo filtrante della ciotola.
Fase 3: estrazione dell'ATP del lievito (la maggior parte del quale proviene da Bretts)
Fase 4: misurazione della bioluminescenza ATP del lievito
Il reagente YLC del kit Brett Alert estrae l’ATP dal lievito Bretts.
L’ingegneria dei reagenti permette di non rilasciare e misurare l’ATP dai batteri dell’acido lattico/acetico, ma solo l’ATP dal lievito.
Una volta che l’ATP del lievito viene rilasciato nella cuvetta del filtro, la cuvetta viene inserita nel cassetto del bioluminometro Wine Alert mini-lab e l’ATP del lievito viene miscelato con la luciferina-luciferasi.
Il tiretto e lo strumento misurano l’emissione di luce in unità di luce relativa.
Un risultato in 30 minuti invece di 7 giorni...
Il kit Brett Alert estrae e analizza l’ATP del lievito in 30 minuti senza analizzare l’ATP dei batteri del vino. I campioni vengono prelevati dal Brettampler appena sopra le fecce, dove i Brett sono in maggioranza durante la fase di maturazione.
L'ingegneria dei reagenti discrimina il lievito vitale dai batteri.
L’ingegneria dei reagenti permette il rilascio di ATP dal lievito con prevalenza di Bretts, senza distruggere i batteri dell’acido lattico/acetico,
Così si può anche eliminare il lievito e il suo ATP per misurare la flora batterica lattica e/o acetica.
Correlazione tra l'Atpmetria del kit Brett Alert e il numero di Brettanomyces vitali.
Anche se alcuni Brettanomyces possono essere polimorfici, è possibile stabilire un valore medio per il contenuto intracellulare di ATP per Brettanomyces, che sono per lo più più piccoli di Saccharomyces, perché il contenuto di Atp delle cellule è proporzionale alla loro dimensione.
Per trovare la correlazione tra il segnale di bioluminescenza Atp rilevato con Brett Alert, è importante prima valutare la dimensione media delle cellule di Brettanomyces e confrontarla con i ceppi di Saccharomyces cerevisae.
Perché? Perché la letteratura dà un valore di ATP intracellulare per i lieviti Saccharomyces cerevisae nel vino di circa 100 femtogrammi (fg) di ATP. In confronto, una singola cellula batterica nel vino contiene in media solo 1 fg.
Le foto e il grafico (a sinistra) confrontano le dimensioni di Brettanomyces Bruxellensis (ceppo Cantillon iris C3) con quelle di Saccharomyces cerevisae (ceppo di fermentazione superiore Safale US-05) e Saccharomyces pastorianus (ceppo di fermentazione inferiore wy2206).
I Bretts sono 3 volte più piccoli (in diametro) del ceppo di fermentazione superiore US-05.
Supponendo che le cellule siano sferiche in base al loro diametro medio, il loro volume medio sarebbe rispettivamente.
- 455 μm3 per il ceppo Sach cerevisae US-05
- 82 μm3 per il ceppo Sacch cerevisae WY2206
- 22 μm3 per il ceppo Brettanomyces C3.
Si dice che il ceppo Saccharo Safale US-05 sia 20 volte più grande del Brett C3 e che il Saccharomyces pastorianus (ceppo WY2206) sia 5 volte più grande di un normale Brettanomyces bruxellensis di medie dimensioni.
Il contenuto intracellulare di ATP di una cellula Brett media che non è ciclicamente vitale ma non coltivabile avrà tra 5 fg e 20fg di ATP intracellulare per cellula.
Una curva di calibrazione ATP del bioluminometro indicherà la quantità media di cellule di Brettanomyces bruxellensis nel campione di vino.
Il fondo della bioluminescenza Atp del campione di vino insieme alla tabella di conversione da ATP a femtogramma Atp sarà sottratto dai valori Atp del campione di vino per dare il numero medio di Brettanomyces bruxellensis.
Uno strumento di allarme efficace per il rilevamento della crescita anomala di Brettanomyces bruxellensis.
Qualsiasi aumento dell’ATP del lievito dopo la fermentazione alcolica, durante la fermentazione malolattica e durante l’invecchiamento del vino in botti o serbatoi è un segno di crescita anomala di Brettanomyces bruxellensis.
Confrontare i valori di ATP del lievito nel vino dopo la fermentazione alcolica con una misurazione di ATP del lievito al momento del controllo permette di rilevare qualsiasi aumento insolito di Bretts e quindi permette all’enologo di intraprendere azioni correttive immediate
Qui nel grafico di sinistra, normalmente, ogni travaso del vino riduce il contenuto di lievito vitale e la biomassa microbica totale, ma nella linea tratteggiata, la bioluminescenza ATP del lievito aumenta in modo anomalo dopo il travaso indicando una proliferazione di Bretts.
Con il Brett Alert, sapete esattamente cosa sta succedendo e potete agire senza aspettare diversi giorni e senza i falsi positivi e i falsi negativi della PCR.
Il mini-laboratorio Wine Alert: uno strumento ergonomico per l'enologo da utilizzare in cantina.
I kit Brett Alert sono utilizzati insieme al nostro laboratorio sul campo Wine Alert.
Questo mini-laboratorio è stato progettato per permettere ai viticoltori che non hanno tecnici di laboratorio qualificati di effettuare le proprie analisi del vino in loco, in modo da ottenere una risposta immediata senza dover inviare i campioni al laboratorio.
Il mini-laboratorio sul campo di Wine Alert mette in sicurezza tutte le attrezzature e i materiali di consumo per l’analisi del vino, per evitare qualsiasi rischio di contaminazione incrociata. Un bioluminometro ad alta sensibilità è fissato con chiusure twist-off e un’impronta.
Il laboratorio da campo Wine Alert (escluso il bioluminometro) è autoclavabile e facilmente smontabile per essere riposto nella sua valigetta.
Brett Alert misura anche il potenziale d'invecchiamento di Brettanomyces
I Brett sono lieviti polimorfi, alcuni formano grappoli, lunghe catene o pseudofe, altri sono molto piccoli. Il fattore di disturbo dipende non solo dal numero di Bretts vitali, ma anche dalle loro dimensioni.
Un Brett molto piccolo e un Brett a grappolo possono essere paragonati a due impianti chimici che producono lo stesso prodotto. Uno ha solo una linea di produzione di etilfenolo, mentre l’altro ne ha cinquanta. Più grande è la dimensione dei Bretts vitali, più grande è il loro ATP intracellulare, e più grande è la bioluminescenza dell’Atp di questi Bretts vitali.
Il Brett Alert è l’unico in grado di misurare l’attività intracellulare totale di tutti i Brett vitali nel campione e quindi di valutare il loro potenziale di causare danni da un campione all’altro.