Aunque la detección de Bretts por PCR es comúnmente utilizada por los enólogos, ¿por qué el análisis por PCR de Bretts en el vino da resultados decepcionantes y, en particular, muchos falsos negativos y falsos positivos? Veamos las razones científicas.
Hay tres tecnologías de detección rápida disponibles en el mercado para la detección de Brett: la Citometría de flujo, la PCR y la PCR en tiempo real, y la Microscopía de epifluorescencia.
De los tres métodos rápidos, los dos métodos más utilizados para analizar la citometría de flujo de Bretts y la PCR (reacción en cadena de la polimerasa)
¿Por qué el análisis de Bretts por PCR en el vino da resultados engañosos y, en particular, muchos falsos negativos y falsos positivos?
Ninguno es utilizable en el campo, todos requieren técnicos de laboratorio capacitados para interpretar los resultados.
La citometría de flujo y la PCR en tiempo real requieren una importante inversión financiera y costos de mantenimiento anuales.
¿Por qué el análisis PCR de Brettanomyces bruxellensis da resultados engañosos?
La matriz del vino es particularmente difícil de analizar por PCR, ya que ésta es muy sensible a ciertos componentes presentes en el vino tinto, responsables en su mayoría de falsos negativos. Sin embargo, en otros casos, el análisis de la PCR también desencadena falsos positivos para el viticultor. Veamos las razones de los falsos negativos.
Los numerosos falsos negativos de la Pcr son un gran obstáculo para el análisis de Bretts viables en el vino.
Los polifenoles, los taninos y otras moléculas del vino tinto inhiben la PCR.
El catión Mg++ es un cofactor muy importante utilizado en los kits de PCR de Brettanomyces para desencadenar la actividad enzimática de la Taq ADN polimerasa, que a su vez aumenta la cantidad de ADN amplificado.
Si el cofactor Mg++ se une de forma inespecífica a diferentes moléculas del vino, dejará de estar disponible para la replicación del ADN y la acción de la polimerasa será reducida o inexistente. El número de Brettanmocyces bruxellensis parecerá insignificante, cuando en realidad está creciendo rápidamente!!
El vino es una matriz especialmente difícil de analizar por PCR. Esto se debe a que el vino inhibe la acción de la polimerasa, y algunas de sus moléculas se unen al ADN objetivo. La enzima polimerasa utilizada no puede unirse al ADN para replicar las hebras.
Se sabe que algunos polifenoles se unen al ADN o incluso se intercalan entre los pares de bases del ADN formando o formando complejos con el ADN, como es el caso del Resveratrol; además de los polifenoles, se sabe que otras sustancias presentes en el vino, como las proteínas y los ácidos orgánicos, inhiben el análisis PCR de Brettanomyces bruxellensis.
¿Cuáles son los tipos de inhibición de la PCR de Bretts que producen falsos negativos?
Inhibición de primers de ADN
Arriba a la izquierda: la desnaturalización del ADN de los Bretts se separa y si no hay sustancias inhibidoras como en el gráfico 1 y 2 de arriba, los cebadores de ADN coinciden con la secuencia de ADN de los Bretts objetivo.
Pero si el vino analizado contiene moléculas inhibidoras, como en el gráfico 3 que se unen a las zonas a las que se dirigen los cebadores, la PCR se inhibe.
Independientemente del método de cuantificación del ADN replicado, ya sea mediante el etiquetado fluorescente de las hebras de ADN o revelando el ADN mediante una prueba colorimétrica en una tira, la señal detectada seguirá siendo débil o incluso inexistente, si la replicación del ADN por la polimerasa ha sido inhibida por las sustancias inhibidoras del vino, lo que es muy frecuente.
Esta inhibición de la PCR hará que el enólogo crea que no se está desarrollando Brett, cuando en realidad los Bretts se están multiplicando.
Por lo tanto, no es de extrañar que los ensayos comparativos de análisis de PCR entre laboratorios publicados en Francia en la revista científica de enología Oeno One (Vol 50, N°4, 2016) hayan mostrado resultados que varían por un factor de 100 o más entre dos laboratorios para la misma muestra.
Pero, ¿qué dicen los científicos? ¿Se han realizado pruebas comparativas para evaluar la fiabilidad de las pruebas PCR para el análisis de Bretts?
Un estudio comparativo entre laboratorios demuestra la poca fiabilidad de la PCR para el análisis de Bretts.
Una conclusión sobre los resultados obtenidos del análisis PCR de las levaduras Brettanomyces que está revelando...
En este sentido, es especialmente interesante la conclusión de estos ensayos comparativos (aquí traducidos al español) que demuestra que el análisis de Brettanomyces por PCR en el vino da resultados poco fiables.
He aquí un extracto de este estudio: “En conclusión, nuestro estudio pone de manifiesto que los kits comerciales para la cuantificación de B. bruxellensis tienen diferentes rendimientos de extracción que conducen a diferentes resultados de cuantificación. Las desventajas de los métodos descritos anteriormente podrían afectar negativamente a la decisión del vinicultor y provocar el deterioro del vino por sobreestimación o subestimación”.
Por ello, no es de extrañar que un gran laboratorio de enología de Francia, que presta servicio a más de 300 cooperativas vinícolas y a más de 1.500 viticultores independientes, haya abandonado la PCR.
Por ello, este laboratorio ya sólo utiliza el método clásico de cultivo de Bretts en agar para sus auditorías de calidad.
Pero, ¿a qué se deben los falsos positivos y la sobreestimación del número de Bretts viables en un análisis de vino por PCR?
¿Por qué el análisis por PCR de la levadura Brettanomyces también da falsos positivos?
Tanto las levaduras Brettanomyces muertas como las vivas conservan su ADN dentro de sus células.
Durante la PCR, el ADN se extrae tanto de los Bretts muertos como de los viables. Es imposible saber de antemano la proporción de Bretts viables en comparación con los Bretts muertos. Como resultado, la PCR es responsable de muchas falsas alarmas. Estos falsos positivos son una pérdida de tiempo y dinero para el vinicultor.
El enólogo ya tiene mucho que ver con la contaminación real de Bretts.
Otras desventajas de los análisis de Bretts por PCR, citometría o microscopía
Ninguno de los métodos rápidos de análisis de Bretts es adecuado para su uso en la bodega. Todos requieren la intervención de técnicos de laboratorio cualificados.
La citometría de flujo y la PCR en tiempo real requieren una importante inversión financiera y costes de mantenimiento anuales.
La interpretación de la microscopía de epifluorescencia es especialmente difícil y requiere mucho tiempo. De hecho, los Brettanomyces tienen muchas formas diferentes. Además, la microscopía no es lo suficientemente sensible para detectar los niveles de alerta temprana, antes de los umbrales críticos de Bretts. Así, el límite de detección requerido por la microscopía de epifluorescencia alcanza el umbral crítico de las poblaciones de Brett en el que la producción de fenol etílico puede llegar a ser crítica. Por lo tanto, ¡está claro que no puede utilizarse como herramienta de advertencia!