Infection lactique

image infection lactique

Détection sous 4 h des bactéries lactiques viables discriminées des levures.

Une des difficultés majeures pour les maîtres brasseurs consiste à
pouvoir identifier très rapidement pendant le brassage toute croissance
anormale de bactéries lactiques sans risque de faux positifs. Une situation particulièrement critique serait la croissance furtive de bactéries lactiques contaminant le moût ou la bière.

Pourquoi parler de croissance furtive?

Parce que les souches de bactéries lactiques résistantes aux composés du houblon telles que celles que l’on trouve en brasserie, sont très difficiles à cultiver sur les géloses classiques utilisées pour les bactéries lactiques (1).

Pourquoi ces bactéries ne croissent pas sur ces gélose? Parce qu’elles sont accoutumées à l’environnement hostile et pauvre en nutriments de la bière, et ces bactéries se retrouvent d’un seul coup sur une gélose extrêment riche en nutriments et meurent. Ce serait comme si une personne qui sort d’une famine se retrouve à être sur-alimentée lors d’un festin, cette personne risquerait de décéder car
son organisme ne serait pas habitué à un excès de nourriture..

Y a t'il des méthodes rapides alternatives permettant des mesures correctrices immédiates?

Pas vraiment.

Les méthodes PCR sont coûteuses, laborieuses à mettre en oeuvre, et nécessitent un minimum de 48 heures d’incubation en milieu sélectif pour la présence/absence d’une souche spécifique.

De plus la PCR ne permet pas de savoir si vos bactéries lactiques sont mortes ou vivantes. Les brins d’ADN si libérés se lient facilement sur les particules, et les bactéries mortes conservent leur ADN intracellulaire.

Si une bactérie lactique ne croit pas en milieu sélectif utilisé avec le kit PCR durant son temps d’incubation, vous ne la détecterez jamais.

Lactobacillus lindneri est un des contaminants majeurs de la bière, qui passe souvent “sous le radar” car nombreuses sont les souches fastidieuses (difficiles à cultiver sur gélose, avec des temps de croissance très long), ou carrément viable non cultivable sur milieu sélectif standard des bactéries lactiques tel que la gélose MRS, mais par contre se multiplie rapidement dans la bière.

Lorsque les flores lactiques atteignent le seuil critique de 10exp5 /mL de bière, une réaction enzymatique irréversible d’altération de la bière se produit. Par exemple il a été rapporté que seulement 20.000 pediocoques/mL dans une bière en fermentation (2) avait produit une concentration en diacetyl de 0.36mg/litre.

L'analyse classique de l'ATP est-elle la solution?

D’autres méthodes tel que l’analyse de l’ATP par bioluminesence ont été utilisées. Le principe de la bioluminescence de l’ATP est basé sur le principe que seuls les cellules viables produisent de l’ATP (Adénosine triphosphate) une molécule utilisée par la cellule pour stocker ou dépenser l’énergie nécessaire au bon fonctionnement de la cellule. Lorsque cet ATP est libéré de cellules viables, lorsque l’ATP est mélangé à un subtrat-enzyme Luciférine-Luciférase (produite par le ver luisant pour produire sa lumière), une réaction de bioluminescence se produit.

reaction de bioluminescence de l'ATP
Lorsque l'adénosine triphosphate (ATP) entre en contact avec la luciférine-luciférase il se produit une réaction de bioluminescence mesurable.

Plus importante est la quantité d’ATP plus importante sera la bioluminescence. Il y a cependant deux obstacles à résoudre pour l’analyses bactéries lactiques de la bière.

  1. L’ATP libéré des cellules céréalières détruites, ou des levures mortes, est extrêmement résistant à la température pouvant aller jusqu’à plus de 500°C pour l’éliminer. Il n’est donc pas étonnant qu’on retrouve des quantités phénoménales d’ATP provenant des céréales ou des levures mortes dans la bière brassée. Si vous ne l’éliminez pas, vous obtiendrez des faux positifs…
  2. Les levures contiennent d’énormes quantité d’ATP intracellulaire par rapport à une cellule bactérienne, et si votre méthode d’analyse par bioluminescence de l’ATP ne peut pas les discriminer l’ATP des bactéries vous avez un problème. En effet la bioluminescence de l’ATP provenant essentiellement des levures abondantes dans la bière, et vous serez incapable de détecter une croissance bactérienne indésirable. Et c’est le cas de tous les kits d’analyse de l’ATP par bioluminescence disponible sur le marché.

L’analyse par bioluminescence de l’ATP peut uniquement être utilisé, si cette méthode est capable d’éliminer l’ATP libre et l’ATP levurien, pour n’analyser ensuite spécifiquement que l’ATP intracellulaire bactérien. Actuellement aucun kits d’ATP disponibles sur le marché, y compris lorsqu’une méthode d’incubation est utilisée avec un bouillon d’enrichissement spécifique. Par exemple c’est le cas même si le bouillon MRS est ajouté avec la cycloheximide (Certaines levures tel que Brettanomyces ainsi que d’autres levures sont résistantes au cycloheximide,même si celui ci est ajouté dans une gélose.)

Une technologie française brevetée résoud ces problèmes en 3 étapes.

Brevet français Atpmétrie Charles Cervin

Etape 1: libération sélective d’ATP levurien & leur élimination ensemble avec l’ATP libre de la bière.

traitement selectif levures étape1

Des réactifs innovants mis au point détruisent selectivement les levures, libèrent leur ATP en s’attaquant à une cible commune aux levures, non présentes sur les bactéries lactiques. L’ATP libéré est ensuite éliminé.

Brett cell before & after treatment

Etape 2 : les bactéries lactiques sont lysées par un réactif de lyse , libérant l’ATP des bactéries lactiques. Ci-dessus observation microscopique de la destruction des levures (ici Brettanomyces).

traitement selectif levures étape 2 et 3

Etape 3: l’ATP libéré des bactéries lactiques est mélangé à la luciférine-luciférase pour produire une bioluminescence augmentant en fonction de la concentration de la population de bactéries lactiques dans l’échantillon.

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Bibliographie scientifique
  1. Suzuki.K et al. 2012. 125th anniversary review: microbial instability of beer caused by spoilage bacteria. Journal of the Institute of Brewing, 117, 131-155
  2. Kissel, T. L., and P. E. Dakin. 1956. Pediococcus: culture method for their detection and a report on their growth characteristics,p. 44-53. In A. Beech (ed.), Proceedings of the 69th Convention of the Master Brewers Association of the Americas.