¿Por qué la Atpmetría convencional de 1ª y 2ª generación arroja falsos positivos y falsos negativos al detectar levaduras o flora bacteriana en una muestra? ¿Cuáles son los desafíos insuperables, y en particular la falta de fiabilidad, a los que se enfrentan los kits de análisis de bioluminiscencia ATP tradicionalmente utilizados para el análisis de superficies en el control de la higiene y para la detección de la flora total en microbiología?
Para ser fiables, los métodos rápidos de análisis de bioluminiscencia de Atp deben ser capaces de superar varios retos técnicos.
Para comprender los retos a los que se enfrentan los kits de ensayo de ATP convencionales, es necesario entender cómo funcionan los diferentes tipos de kits de ensayo de bioluminiscencia de ATP.
Los métodos convencionales de ensayo de bioluminiscencia de ATP disponibles en el mercado se dividen en dos categorías:
- Kits de ATP-metría de primera generación
- Kits de ATP-metría de segunda generación
Cada una de estas categorías de pruebas de bioluminiscencia Atp tiene sus propias limitaciones.
Pero primero veamos la diferencia entre estos dos tipos de kits de pruebas de bioluminiscencia de ATP, para entender los desafíos.
Los clásicos kits de Bioluminiscencia del ATP de 1ª y 2ª generación;
Los kits de Atpmetría de primera generación se refieren al método de análisis de Atp total por bioluminiscencia, en el que todas las moléculas de Atp libres y las intracelulares se analizan juntas sin ninguna discriminación.
Los kits de Atpmetría de segunda generación se refieren a los métodos de análisis de bioluminiscencia de ATP que cuantifican únicamente el ATP intracelular, sin discriminar el tipo de célula, ya sean células vegetales, somáticas o de microorganismos.
Antes de examinar los problemas técnicos que los kits de Atpmetría de 1ª y 2ª generación no resuelven, es útil entender el impacto de las diferentes moléculas y células en las muestras sobre la bioluminiscencia del Atp medido.
¿Qué moléculas y células de la muestra afectan a la bioluminiscencia del Atp?
Los métodos convencionales para medir la bioluminiscencia del ATP (trifosfato de adenosina) tienen muchos problemas técnicos sin resolver. Esto hace que los resultados de sus kits de ATPmetría no sean fiables. Veamos por qué.
Retos técnicos no resueltos de los kits de atpmetría de 1ª y 2ª generación...
Las sustancias inhibidoras provocan falsos negativos.
La Atp libre provoca falsos positivos.
Muchas moléculas presentes en las bebidas, y otros líquidos, si no se eliminan (dióxido de azufre, iones metálicos, taninos, polifenoles) inhiben la reacción de bioluminiscencia del ATP, como se ha publicado en estudios científicos.
El hisopado recoge restos de detergentes en la superficie que se liberan con el extractor en el tubo de análisis del luminómetro que contiene luciferina-luciferasa.
Estas sustancias inhibidoras reducirán por tanto la reacción de bioluminiscencia desencadenada por la presencia de luciferina-luciferasa con el ATP recuperado.
Por lo tanto, los valores de luminiscencia detectados por el bioluminómetro serán más bajos de lo que deberían ser, debido a este efecto inhibidor y darán resultados falsos negativos.
Estos falsos negativos harán creer al usuario que la población microbiana de la muestra es baja o inexistente, cuando en realidad es lo contrario.
Algunas bebidas, y en particular la cerveza, pueden contener mucho ATP libre de origen vegetal liberado durante la elaboración por las células vegetales lisadas.
En cambio, cuando las levaduras se multiplican, brotan y producen células hijas. Estas células hijas se desprenden de la célula madre y liberan enormes cantidades de ATP en este momento crucial.
Si este ATP libre no se destruye o se elimina, se analiza junto con el ATP de los microorganismos, y da resultados falsos positivos.
Estos falsos positivos sugieren que la muestra analizada contiene muchos microorganismos, mientras que los valores de bioluminiscencia se deben principalmente al ATP libre…
La Atpmetría de 1ª o 2ª generación no es específica.
En una mezcla de diferentes células de distinto origen, los métodos convencionales de medición de la bioluminiscencia del Atp, ya sea de 1ª o 2ª generación, no consiguen discriminar el Atp microbiano del ATP de otras células vegetales o somáticas, por ejemplo, en el muestreo de superficie.
Los reactivos utilizados generalmente lisan todas las células sin discriminación del tipo de célula, y liberan ATP de todas las células. Esto es particularmente problemático ya que algunas células no microbianas contienen enormes cantidades de ATP y por lo tanto los valores de bioluminiscencia por este Atp no microbiano nunca podrán cuantificar la población de microorganismos.
Los kits de Atpmetría de 3ª generación abordan estos retos.
Los kits de ATPmetría de tercera generación se refieren a un método de cuantificación del ATP intracelular microbiano discriminado del ATP libre y del ATP de las células somáticas.
Este tipo de ensayo de ATP utiliza una combinación de una cubeta de fondo de filtro con un extractor de ATP de células somáticas y un reactivo de lisis microbiana.
Este método de análisis de bioluminiscencia ATP se ha utilizado con éxito y se ha publicado en numerosos estudios que correlacionan el análisis de atpmetría y los resultados de los cultivos en agar para: agua potable, agua de piscinas, fluidos de corte, esporas de bacilos, análisis de superficies, aire y canales de carne.
El kit de prueba de Atp de tercera generación fue designado originalmente como kit Profile-1 e inventado por New Horizons Diagnostics Inc. en Baltimore, Estados Unidos. El kit se utilizó por primera vez para detectar esporas de bacilos en aerosoles biológicos durante la guerra de la Tormenta del Desierto en Irak, y más tarde para realizar pruebas de higiene en canales de carne y agua potable.
Este kit concentra las células con una jeringa y un concentrador de células que contiene un recipiente con filtro extraíble el Filtravette™.
Esta invención Filtravette™ permite concentrar, lixiviar las sustancias inhibidoras y el ATP libre, el ATP de las células somáticas contenido en la muestra, hacer diferentes tratamientos de la muestra y desencadenar y cuantificar la reacción de bioluminiscencia del Atp, todo en la misma cubeta.
El kit de Atpmetría de 3ª generación concentra las células a analizar, libera el Atp somático, lixivia el Atp libre y somático, añade la luciferina-luciferasa y mide la bioluminiscencia del ATP en la misma placa de filtro.
Lixiviación efectiva de los inhibidores.
Aquí, a la derecha, dos gráficos muestran la eficacia de la lixiviación de la Filtravette con el reactivo de lixiviación SRA, muestras líquidas que contienen diferentes concentraciones de un detergente TCA y lejía y el impacto en la señal de bioluminiscencia ATP con o sin lixiviación de la Filtravette.
Numerosos estudios de correlación con kits de Atpmetría de tercera generación.
El kit de atpmetría de 3ª generación Profile-1, debido a su fiabilidad y resistencia a las sustancias inhibidoras, ha sido objeto de numerosos estudios por parte de científicos independientes. Estos estudios han validado la correlación entre los métodos de cultivo en agar y los valores de bioluminiscencia Atp en una muestra medida con el Profile-1
Seleccione los estudios de correlación publicados en inglés haciendo clic en los diferentes botones de abajo.
Sin embargo, los kits de análisis de ATP de 3ª generación tienen sus límites, ya que no discriminan selectivamente los microorganismos por otros no dirigidos.
El reto de las bacterias adheridas a la levadura para los kits de atpmetría de tercera generación.
Otro obstáculo importante. La levadura no puede separarse fácilmente de todas las bacterias acéticas y lácticas. Algunas bacterias se adhieren a las células de la levadura y forman agregados microbianos.
Por lo tanto, es imposible con los métodos clásicos de medición de ATP, ya sean de 1ª o 2ª generación, diferenciar las bacterias de las levaduras, cuando se analiza el ATP de las levaduras con el de las bacterias.
Esta es una de las razones por las que la Atpmetría clásica no se utiliza en enología, salvo para los controles de higiene. Una sola célula de levadura contiene tanto ATP como 100 células bacterianas viables.
Por otro lado, se pueden encontrar grandes poblaciones de bacterias lácticas (de 10 poder 7/ml) en el vino de maduración. Estas bacterias distorsionan los resultados si queremos conocer el número de levaduras viables.
¿Significa esto que no hay solución a estos desafíos técnicos? Por el contrario, una tecnología ha encontrado la solución: la ATPmetría selectiva rápida que discrimina entre la levadura y ciertas bacterias.
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