Le dénombrement rapide sur site des Brettanomyces bruxellensis: des millions de dollars d'économie.
Des millions de dollars sont perdus chaque année par les vignerons suite à l’altération des vins rouges par les Brettanomyces. bruxellensis, . Cependant une technologie de détection innovante, vient changer la donne le Brett Alert. Cette technologie rapide sur site est utilisable par tous les vignerons et:
- détecte en 30 minutes sur site dans le chai les seuils pré-critiques des Brettanomyces dans le vin de fond de cuve ou de barrique, discriminés des Bretts mortes.
- résout les faux positifs des kits d’analyse PCR des Bretts, déclenchés par les micro-organismes mort
- résout les faux négatifs de kit d’analyse Brettanomyces par PCR , inhibés par les polyphénols et les tanins
- et permet au vigneron une action corrective immédiate dans le chai, ceci avant d’atteindre des seuils critiques incurables.
Comment fonctionne la détection rapide de Brettanomyces viables par bioluminescence Atp sélective ?
Le kit Brett Alert détecte rapidement les Brettanomyces viables là où les Bretts sont la principale population de levures majoritaire dans les lies, après la fermentation alcoolique, pendant la fermentation malolactique et l’élevage du vin post FML en barrique. Au contraire des levures aérobies de voile qui aiment rester en surface près de la bonde, les Brettanomyces se développent dans les lies et sont rares, voire inexistantes, en surface et en milieu de barrique ou de cuve d’élevage.
Bien que les réactifs du kit Brett Alert ne permettent pas de distinguer spécifiquement les Brettanomyces des autres levures, ils analysent les échantillons de vin du fond de barrique et de fond de cuve où les Bretts constituent la principale population. C’est une garantie que la détection de la bioluminescence de l’ATP détecté avec le Brett Alert provient essentiellement de Brettanomyces viables. Brett Alert peut donc être utilisé comme un outil efficace d’alerte de croissance anormale des levures Brettanomyces.
A l'inverse de l'analyse des Bretts par PCR, le Brett Alert discrimine les Bretts vivantes des mortes…
L’ATP intracellulaire des levures n’est produite que si les levures sont vivantes. La mesure de l’ATP des levures est donc une bonne méthode pour distinguer les levures Brettanomyces vivantes des levures Brettanomyces mortes. Plus la réaction de bioluminescence mesurée est élevée, plus la taille et le nombre de cellules de levures Brett vivantes sont importants.
Brett Alert discrimine les vrais Bretts VNC de celles qui sont réellement mortes.
Les cellules de Brettanomyces viables non cultivables (VNC) seront toujours détectées par la mesure de bioluminescence de l’ Atp ou Atpmétrie, bien que leur taille diminue. Le kit Brett Alert permet de distinguer les cellules de Brettanomyces viables non cultivables des cellules de Brettanomyces réellement mortes.
Très souvent, la PCR surestime le nombre réel de Bretts VNC car la PCR n’est pas capable de discriminer les unités génomiques des cellules mortes des vivantes.
Une façon très simple de tester le kit Brett Alert et la PCR pour voir leur capacité à distinguer les Brett mortes des vivantes, est d’analyser les Brettanomyces traitées avec une forte concentration de dioxyde de soufre, où nous sommes sûrs que les Brettanomyces sont mortes et de comparer les deux résultats.
Comment fonctionne le Brett Alert?
Le kit Brett Alert utilise une technologie brevetée de bioluminescence sélective de l’ATP, pour extraire et analyser l’ATP de la levure en 30 minutes sans analyser l’ATP des bactéries du vin, au lieu d’attendre plus de 7 jours les résultats des comptages sur géloses.
Les échantillons de vins analysés sont prélevés juste au-dessus des lies, là où les Bretts sont majoritaires l’élevage du vin.
Le Brett Alert utilise:
le Brettsampler pour prélever le vin en fond de barrique là où les Bretts sont majoritaires,
couplé à l’analyse selective de l’Atp levurien discriminé de l’ATP bacterien du vin.Etape 1: prélever le vin et concentrer les Brettanomyces
Etape 2: Lessivage des substances inhibitrices et de l'Atp libre
Le Brett Alert évacue la majeure partie des polyphénols et des tannins qui inhibitent la bioluminescence de l’ATP, ainsi que l’ATP libre provenant du raisin ou de microorganismes morts, grâce à un système ingénieux de lessivage.
Les tanins et les anthocyanes sont évacués par lessivage à travers le fond filtrant d’une cuvette, substances ensuite absorbées par capilarité par un buvard en contact avec le fond filtrant de la cuvette.
Etape 3: extraction de l'ATP levurien (dont la majorité provient des Bretts)
Etape 4: mesure de la bioluminescence de l'ATP levurien
Le réactif YLC du kit Brett Alert extrait l’ATP des levures de Bretts.
L’ingénierie des réactifs permet de ne pas libérer et mesurer l’ATP des bactéries lactiques/acétiques, mais uniquement l’ATP des levures.
Une fois que l’ATP de la levure est libéré dans la cuvette-filtre, la cuvette est introduite dans le tiroir du bioluminomètre du laboratoire Wine Alert et l’ATP de la levure est mélangé à la luciférine-luciférase. Le tiroir et l’instrument mesurent l’émission de lumière en unités de lumière relative.
Un résultat en 30 min au lieu de 7 Jours ...
Le kit Brett Alert, extrait et analyse l’ATP des levures en 30 minutes sans analyser l’ATP des bactéries du vin. Les échantillons analysés sont prélevés par le Brettsampler juste au-dessus des lies, là où les Bretts sont majoritaires en phase d’élevage.
Une ingénierie de réactifs discrimine les levures viables des bactéries ..
L’ingénierie des réactifs, permet de libérer l’ATP des levures dont les Bretts sont prédominantes , sans détruire les bactéries lactiques/acétiques,
Ainsi l’on peut aussi éliminer les levures et leur ATP pour mesurer les flores bactériennes lactiques et/ou acétiques.
Corrélation de l'Atpmétrie du Brett Alert avec les Brettanomyces viables.
Bien que certaines Brettanomyces puissent être polymorphes, il est cependant possible d’établir une valeur moyenne de teneur d’ATP intracellulaire par Brettanomyces, la plupart du temps plus petites que les Saccharomyces, car la teneur en Atp des cellules est proportionnel à leur taille.
Pour trouver la corrélation entre le signal de bioluminescence d’Atp détecté avec Brett Alert, il est important d’évaluer d’abord la taille moyenne des cellules de Brettanomyces et de les comparer avec les souches de Saccharomyces cerevisae.
Pourquoi ? Parce que la littérature donne une valeur en ATP intracellulaires des levures Saccharomyces cerevisae dans le vin d’environ 100 femtogrammes (fg) d’ATP. En comparaison, une seule cellule bactérienne dans le vin contient en moyenne seulement 1 fg.
Les photos et le graphique ci-contre à gauche comparent la taille de Brettanomyces Bruxellensis (souche Cantillon iris C3) à celle de Saccharomyces cerevisae (souche de fermentation haute Safale US-05) et Saccharomyces pastorianus (souche de fermentation basse wy2206).
Les Bretts sont 3 fois plus petites (en diamètre) que la souche US-05 de fermentation haute.
En supposant que les cellules sont sphériques sur la base de leur diamètre moyen, leur volume moyen serait respectivement de .
- 455 μm3 pour la souche US-05 de Sach cerevisae
- 82 μm3 pour la souche WY2206 de Sacch cerevisae
- 22 μm3 pour la souche C3 de Brettanomyces.
La souche US-05 de Saccharo Safale serait 20 fois plus grande que la Brett C3 et Saccharomyces pastorianus (souche WY2206) serait 5 fois plus grande qu’une Brettanomyces bruxellensis de taille moyenne normale.
Le contenu intracellulaire en ATP d’une cellule de Brett moyenne qui n’entre pas dans un cycle viable mais non cultivable, aura entre 5 fg et 20fg d’ATP intracellulaire par cellule.
La réalisation d’une courbe de calibration de l’ATP du bioluminomètre permettra de connaître la quantité moyenne de cellules de Brettanomyces bruxellensis dans l’échantillon de vin.
Le bruit de fond de la bioluminescence Atp de l’échantillon de vin avec le tableau de conversion de l’ATP en femtogramme d’Atp, sera soustrait des valeurs d’Atp de l’échantillon de vin vous donnera le nombre moyen de Brettanomyces bruxellensis.
Un outil d'alerte efficace pour la détection de croissance anormale de Brettanomyces bruxellensis.
Toute augmentation d’ATP issus des levures après fermentation alcoolique, pendant la fermentation malolactique et pendant l’elevage du vin en barrique ou en cuve d’élevage est le signe d’une croissance anormale de Brettanomyces bruxellensis.
La comparaison des valeurs d’ATP levurien dans le vin après la fermentation alcoolique avec une mesure d’Atp levurien au moment du controle permet de détecter toute augmentation inhabituelle de Bretts et permet au vinificateur de prendre ainsi des mesures correctives immédiates
Ici sur le graphique de gauche normalement, chaque soutirage du vin réduit la teneur en levures viables, et la biomasse microbienne totale, mais en pointillé, la bioluminescence d’ATP levurien augmente anormalment après le soutirage ce qui indique une prolifération de Bretts.
Avec le Brett Alert, vous savez donc exactement ce qui se passe et vous pouvez agir sans attendre plusieurs jours et sans les faux positifs et faux négatifs de la PCR.
Le Brett Alert mesure aussi le potentiel de nuisance des Bretts
Les Bretts sont des levures polymorphes, certaines forment des amas, de longues chaines, ou des pseudo-hyphe., d’autres sont toutes petites. Le facteur de nuisance dépend non seulement du nombre de Bretts viables, mais aussi de leur taille. Une toute petite Brett, et une Brett en amas, peuvent se comparer à deux usines chimiques fabriquant le même produit. L’’une n’a qu’une ligne de production d’éthylphénols, tandis que l’autre en a cinquante. Plus la taille des Bretts viables est importante, plus leur ATP intracellulaire l’est aussi, et plus la bioluminescence de l’Atp de ces Bretts viables le sera aussi.
Le mini-labo Wine Alert: un outil ergonomique pour le vigneron utilisable dans le chai.
Les kits Brett Alert sont utilisés avec notre laboratoire de terrain Wine Alert.
Ce mini-labo a été conçu pour permettre aux vignerons qui disposent pas nécessairement des techniciens de labo qualifiés d’effectuer eux-mêmes leurs analyses de vin sur place, afin d’avoir une réponse immédiate sans avoir à envoyer des échantillons au labo.
Le mini-labo de terrain de Wine Alert sécurise tous les équipements et consommables pour l’analyse du vin, afin d’éviter tout risque de contamination croisée. Un bioluminomètre à haute sensibilité est sécurisé par des fixations dévissables et une empreinte.
Le laboratoire de terrain Wine Alert (hors le bioluminomètre) est autoclavable et facilement démontable pour le ranger dans sa mallette de transport.
Le Brett Alert est seul capable à mesurer l’activité intracellulaire totale de l’ensemble des Bretts viables de l’échantillon et à évaluer donc leur potentiel de nuisance d’un échantillon à un autre.