Bien que la détection des Bretts par PCR soient couramment utlisés par les vignerons, pourquoi l’analyse par PCR des Bretts du vin donne des résultats décevants et en particulier beaucoup faux négatifs et des faux positifs? Voyons les raisons scientifiques.
Bien que trois technologies de détection rapide des Bretts sont disponibles sur le marché:
Ce sont les kits d’analyses des Bretts par PCR qui sont les plus couramment utilisés, ceci malgré de nombreux résultats PCR décevants,, Ce manque de fiabilité des résultats obtenus pour l’analyse des Bretts, vient principalement de la difficulté d’analyser une matrice comme le vin rouge.
Pourquoi l'analyse PCR des Bretts donnent des résultats décevants?
La matrice du vin est particulièrement difficile à analyser par PCR , car la PCR est très sensible à certains composants présents dans le vin rouge, responsable pour la plupart du temps de faux négatifs. Cependant dans d’autres cas, l’analyse par PCR déclenche aussi des faux positifs pour le vigneron. Voyons ensemble les d’abord les raisons des faux négatifs.
Les nombreux faux négatifs de la Pcr un handicap majeur à l'analyse des Bretts viables dans le vin.
Les polyphénols, les tannins et d’autres molécules du vin rouge inhibent la PCR.
Le cation Mg++ est un cofacteur très important utilisé dans les kits PCR de Brett, pour déclencher l’activité enzymatique de l’ADN polymérase Taq, qui à son tour augmente le taux d’ADN amplifié.
Si le cofacteur Mg++ se lie de manière non spécifique à différentes molécules présentes dans le vin, il ne sera plus disponible pour la réplication de l’ADN, et l’action de la polymérase sera réduite voire inexistante. Le nombre de Bretts paraitra insignifiant alors qu’en réalité elles sont en plein croissance!!
Le vin est une matrice particulièrement difficile à analyser par PCR. Car le vin inhibe l’action de la polymerase, et certaines de ses molécules se fixe sur l’ADN , ciblé. L’enzyme polymérase utilisée ne peut se fixer sur l’ADN pour répliquer les brins.
Certains polyphénols sont connus pour se fixer sur l’ADN voire même à s’intercaler, entre les paires de bases d’ADN formant ou à former complexes avec l’ADN comme le Resveratrol; En plus des polyphénoles, d’autres substances du vin tel que les protéines et les acides organiques sont connus pour inhiber l’analyse par PCR des Bretts
Les différentes inhibitions de la Pcr des Bretts qui déclenchent des faux négatifs.
Inhibition des amorces
Ci-dessus à gauche: la dénaturation de l’ADN des Bretts se séparent et s’il n’y a pas de substances inhibitrices tel que sur le graphique 1 et 2 ci-dessus, les amorces d’ADN s’apparient à la séquence d’ADN des Bretts qui est ciblé. Mais si le vin analysé contient des molécules inhibitrices qui se fixent sur les zones ciblées par les amorces, la PCR est inhibée;
Peu importe la méthode de quantification de l’ADN répliqué, que ce soit par un marquage fluorescent des brins d’ADN ou que ce soit par une révélation de l’ ADN par un test colorimétrique sur bandelette, le signal détecté restera faible voire inexistant, si la réplication de l’ADN par la polymérase a été inhibée par les sustances inhibitrices du vin, ce qui est très fréquent.
Ainsi cette inhibition de la PCR fera croire au vigneron qu’aucune Brett ne se développe alors qu’en réalité les Bretts se multiplient.
Ainsi il n’est pas surprenant que des essais comparatifs d’analyses PCR inter-laboratoires publié en France dans le journal scientifique d’oenologie Oeno One (Vol 50, N°4, 2016) ont démontré des résultats variant d’un facteur de 100 voire plus, entre deux laboratoires pour le même échantillon.
Mais qu’en disent les scientifiques? Y-a-t’il eu des tests comparatifs permettant d’évaluer la fiabilité des test PCR pour l’analyse des Bretts.
Une étude comparative démontre le manque de fiabilité de la PCR pour les Bretts.
Une conclusion sur les résultats Bretts obtenus PCR révélateurs...
A ce sujet, la conclusion de ces essais comparatifs est particulièrement intéressante (ici traduite en français) et démontrent que l’analyse des Brettanomyces par PCR dans le vin par PCR donne des résultats peu fiables.
Voici donc un extrait de cette étude ” En conclusion, notre étude souligne que les kits commerciaux pour la quantification de B. bruxellensis ont des rendements d’extraction différents menant à des résultats de quantification différents. Les inconvénients des méthodes décrites ci-dessus pourraient affecter négativement la décision du viticulteur et entraîner une altération du vin due à une surestimation ou à une sous-estimation.“
De ce fait il n’ est pas étonnant qu’un trés gros laboratoire d’oenologie en France desservant plus de 300 coopératives viticoles et plus de 1500 vignerons indépendants a abandonné la PCR.
Ainsi ce labo n’ utilise désormais pour ses audits qualité, que la méthode classique de mise en culture des Bretts sur gélose.
Mais qu’est ce qui est responsable de faux positifs, et d’une surestimation du nombre de Bretts viables lors d’une analyse du vin par la PCR,?
Pourquoi l'analyse des Bretts par PCR déclenche aussi des faux positifs?
Les Bretts mortes tout comme les Bretts vivantes conservent leur ADN à l’intérieur de leur cellule.
Lors de la PCR, l’ADN est extrait aussi bien des Bretts mortes que des Bretts viables. Il est impossible de connaître à l’avance la proportion de Bretts viables comparée aux Bretts mortes. De ce fait la PCR est responsable de nombreuses fausses alertes. Ces faux positifs sont une perte de temps et d’argent pour le vigneron.
Celui-ci a déjà fort à faire avec les contaminations réelles de Bretts.
Autres inconvénients des analyses de Bretts par PCR, cytométrie ou microscopie.
Aucune des méthodes rapides d’analyse de Bretts ne sont utilisables dans le chai. Toutes nécessitent l’intervention de techniciens de laboratoire qualifiés.
La cytométrie en flux et la PCR en temps réel mobilise un investissement financier important et des coûts de maintenance annuels non négligeables.
La microscopie à épifluorescence est particulièrement difficile à interpréter et fastidieuse. En effet les Brettanomyces ont de nombreuses formes différentes. De plus la microscopie n’est pas assez sensible pour détecter les niveaux des seuil d’alerte précoce, avant les seuils critiques de Bretts. Ainsi la limite de détection requise pour la microscopie à épifluorescence atteint le seuil critique de populations de Brett où la production d’éthyl-phénols peut devenir critique. Il est donc clair qu’elle ne peut servir d’outil d’alerte!!