Enumeración rápida in situ de Brettanomyces bruxellensis: millones de dólares ahorrados.
Los productores de vino pierden cada año millones de dólares debido al deterioro de los vinos tintos por Brettanomyces. bruxellensis. Sin embargo, una innovadora tecnología de detección, Brett Alert, está cambiando las cosas. Esta rápida tecnología in situ puede ser utilizada por todos los viticultores y:
- detecta en 30 minutos in situ en la bodega los umbrales pre-críticos de Brettanomyces en el vino en el fondo de la cuba o la barrica, discriminado del Brett muerto.
- resuelve los falsos positivos de los kits de análisis PCR para Bretts, provocados por microorganismos muertos
- resuelve los falsos negativos de los kits de análisis PCR de Brettanomyces, inhibidos por polifenoles y taninos
- y permite al enólogo tomar medidas correctivas inmediatas en la bodega antes de alcanzar umbrales críticos e incurables.
¿Cómo funciona la detección rápida de Brettanomyces viables mediante bioluminiscencia Atp selectiva?
El kit Brett Alert detecta rápidamente los Brettanomyces viables cuando los Bretts son la principal población de levaduras en las lías, después de la fermentación alcohólica, durante la fermentación maloláctica y durante la crianza en barrica posterior a la FML. A diferencia de las levaduras de vela aeróbicas, a las que les gusta permanecer en la superficie cerca del tapón, los Brettanomyces prosperan en las lías y son raros, si no inexistentes, en la superficie y en el centro de la barrica o del tanque.
Aunque los reactivos del kit Brett Alert no distinguen específicamente los Brettanomyces de otras levaduras, sí analizan las muestras de vino del fondo de la barrica y del fondo del depósito donde los Bretts son la población principal. Esto es una garantía de que la bioluminiscencia ATP detectada con Brett Alert procede principalmente de Brettanomyces viables. Por lo tanto, Brett Alert puede utilizarse como una herramienta eficaz de alerta para el crecimiento anormal de las levaduras Brettanomyces.
A diferencia del análisis por PCR de Brettananomyces, el Brett Alert discrimina entre Bretts vivos y muertos...
El ATP intracelular en la levadura sólo se produce si la levadura está viva. La medición del ATP de la levadura es, por tanto, un buen método para distinguir entre la levadura Brettanomyces viva y la muerta. Cuanto mayor sea la reacción de bioluminiscencia medida, mayor será el tamaño y el número de células vivas de Brettanomyces.
Correlación del kit Brett Alert Atpmetry con los Brettanomyces viables.
Aunque algunas levaduras Brettanomyces pueden ser polimórficas, es posible establecer un valor medio para el contenido de ATP intracelular de Brettanomyces, que son en su mayoría más pequeñas que Saccharomyces, porque el contenido de Atp de las células es proporcional a su tamaño.
Para encontrar la correlación entre la señal de bioluminiscencia Atp detectada con Brett Alert, es importante evaluar primero el tamaño medio de las células de Brettanomyces y compararlo con las cepas de Saccharomyces cerevisae.
¿Por qué? Porque la literatura da un valor de ATP intracelular de las levaduras Saccharomyces cerevisae en el vino de unos 100 femtogramos (fg) de ATP. En comparación, una sola célula bacteriana en el vino contiene de media sólo 1 fg.
Las fotos y el gráfico de la izquierda comparan el tamaño de Brettanomyces Bruxellensis (cepa Cantillon iris C3) con Saccharomyces cerevisae (cepa Safale US-05 de fermentación superior) y Saccharomyces pastorianus (cepa wy2206 de fermentación inferior).
Los Bretts son 3 veces más pequeños (en diámetro) que la cepa de fermentación superior US-05.
Suponiendo que las células son esféricas según su diámetro medio, su volumen medio sería respectivamente.
- 455 μm3 para la cepa Sach cerevisae US-05
- 82 μm3 para la cepa WY2206 de Sacch cerevisae
- 22 μm3 para la cepa C3 de Brettanomyces.
La cepa US-05 de Saccharo Safale es 20 veces más grande que la Brett C3 y la Saccharomyces pastorianus (cepa WY2206) es 5 veces más grande que una Brettanomyces bruxellensis normal de tamaño medio.
El contenido de ATP intracelular de una célula Brett media que no sea ciclable pero sí viable tendrá entre 5 fg y 20fg de ATP intracelular por célula.
Una curva de calibración del bioluminómetro ATP proporcionará la cantidad media de células de Brettanomyces bruxellensis en la muestra de vino.
El fondo de la bioluminiscencia Atp de la muestra de vino, junto con la tabla de conversión de ATP a femtogramo Atp, se restará de los valores Atp de la muestra de vino para obtener el número medio de Brettanomyces bruxellensis.
El kit Brett Alert discrimina entre los verdaderos Brettanomyces viables no cultivables y los que están realmente muertos.
Las células viables no cultivables de Brettanomyces (VNC) seguirán siendo detectadas por la medición de bioluminiscencia Atp o Atpmetría, aunque disminuirán de tamaño. El kit Brett Alert puede utilizarse para distinguir las células Brettanomyces viables no cultivables de las células Brettanomyces verdaderamente muertas.
Muy a menudo, la PCR sobreestima el número real de VNC Bretts porque la PCR no es capaz de discriminar las unidades genómicas de las células muertas de las vivas.
Una forma muy sencilla de probar el kit Brett Alert y la PCR para ver su capacidad de distinguir entre Brett vivo y muerto es analizar los Brettanomyces tratados con una alta concentración de dióxido de azufre, donde estamos seguros de que los Brettanomyces están muertos, y comparar los dos resultados.
Una herramienta de alerta eficaz para la detección del crecimiento anormal de Brettanomyces bruxellensis.
Cualquier aumento del ATP de la levadura después de la fermentación alcohólica, durante la fermentación maloláctica y durante el envejecimiento del vino en barricas o depósitos es un signo de crecimiento anormal de Brettanomyces bruxellensis.
La comparación de los valores de ATP de la levadura en el vino después de la fermentación alcohólica con una medición de ATP de la levadura en el momento del control permite la detección de cualquier aumento inusual de Bretts y, por lo tanto, permite al enólogo tomar medidas correctivas inmediatas
Aquí, en el gráfico de la izquierda, normalmente, cada trasiego del vino reduce el contenido de levaduras viables, y la biomasa microbiana total, pero en la línea de puntos, la bioluminiscencia del ATP de la levadura aumenta anormalmente después del trasiego indicando una proliferación de Bretts.
Con la Alerta Brett, usted sabe exactamente lo que está pasando y puede actuar sin esperar varios días y sin los falsos positivos y falsos negativos de la PCR.
¿Cómo funciona el kit Brett Alert?
El kit Brett Alert utiliza una tecnología patentada de bioluminiscencia selectiva de ATP para extraer y analizar el ATP de las levaduras en 30 minutos sin analizar el ATP de las bacterias del vino, en lugar de esperar más de 7 días a los resultados de los recuentos en agar.
Las muestras de vino analizadas se toman justo por encima de las lías, donde los Bretts son mayoritarios cuando el vino envejece.
El Brett Alert utiliza:
el “Brettsampler” para probar el vino en el fondo del barril donde los Bretts son mayoría,
junto con el análisis selectivo del ATP de levadura discriminado del ATP bacteriano en el vino.
Etapa 1: tomar el vino y concentrar los Brettanomyces
Etapa 2: Eliminación de los inhibidores y de la Atp libre
El kit Brett Alert elimina la mayoría de los polifenoles y taninos que inhiben la bioluminiscencia del ATP, así como el ATP libre de la uva o de los microorganismos muertos, mediante un ingenioso sistema de lixiviación.
Los taninos y las antocianinas son lixiviados a través del fondo filtrante de un recipiente, sustancias que luego son absorbidas por capilaridad por un papel secante en contacto con el fondo filtrante del recipiente.
Etapa 3: extracción del ATP de la levadura (la mayor parte del cual proviene de Brettanomyces)
Etapa 4: Medición de la bioluminiscencia del ATP de la levadura
El reactivo YLC del kit Brett Alert extrae el ATP de la levadura Bretts.
La ingeniería de reactivos permite no liberar y medir el ATP de las bacterias lácticas/acéticas, sino sólo el ATP de las levaduras.
Una vez que el ATP de la levadura se libera en la cubeta del filtro, la cubeta se inserta en el cajón del bioluminómetro del laboratorio Wine Alert y el ATP de la levadura se mezcla con la luciferina-luciferasa. El cajón se cierra y el instrumento mide la emisión de luz en unidades luminosas relativas.
El minilaboratorio Wine Alert: una herramienta ergonómica para que el enólogo la utilice en la bodega.
Los kits Brett Alert se utilizan junto con nuestro laboratorio de campo Wine Alert.
Este minilaboratorio se ha diseñado para que los viticultores que no dispongan de técnicos de laboratorio cualificados puedan realizar sus propios análisis de vino in situ, de modo que puedan obtener una respuesta inmediata sin tener que enviar las muestras al laboratorio.
El minilaboratorio de campo de Wine Alert asegura todo el equipo y los consumibles para el análisis del vino, para evitar cualquier riesgo de contaminación cruzada. Un bioluminómetro de alta sensibilidad se fija con cierres de rosca y una huella.
El laboratorio de campo de Wine Alert (excluyendo el bioluminómetro) es autoclavable y se desmonta fácilmente para guardarlo en su maleta de transporte.
Un resultado en 30 minutos en lugar de 7 días...
El kit Brett Alert extrae y analiza el ATP de las levaduras en 30 minutos sin analizar el ATP de las bacterias del vino. Las muestras se toman con el Brettampler justo por encima de las lías, donde los Bretts son mayoritarios durante la fase de maduración.
La ingeniería de reactivos discrimina las levaduras viables de las bacterias .
La ingeniería de reactivos permite la liberación de ATP de la levadura con predominio de Bretts, sin destruir las bacterias lácticas/acéticas,
Así, también se puede eliminar la levadura y su ATP para medir la flora bacteriana láctica y/o acética.
La Alerta Brett también mide el potencial de molestia de los Bretts
El Brett Alert es el único capaz de medir la actividad intracelular total de todos los Bretts viables en la muestra y, por lo tanto, evaluar su potencial para causar daño de una muestra a otra