Anche se l’analisi PCR di Brettanomyces bruxellensis è comunemente usata per l’analisi microbiologica del vino, i kit di analisi Brett basati sulla PCR danno falsi negativi e falsi positivi, indipendentemente dal fatto che si usi la RT-qPCR o la PCR. Vediamo perché.
Perché l’analisi dei Brettanomyces vitali nel vino tramite PCR dà principalmente falsi negativi e falsi positivi?
Sul mercato sono disponibili tre tecnologie di rilevamento rapido per il rilevamento del deterioramento del lievito Brettanomyces:
la citometria a flusso, la PCR e la PCR in tempo reale, e la microscopia a epifluorescenza.
I kit PCR per l’analisi dei Bretts sono i più utilizzati, nonostante i molti risultati PCR deludenti.
La mancanza di affidabilità dei risultati ottenuti per l’analisi dei Bretts è dovuta principalmente alla difficoltà di analizzare una matrice come il vino rosso.
Perché l'analisi PCR di Bretts dà risultati deludenti e inaffidabili?
La matrice del vino è particolarmente difficile da analizzare tramite PCR, poiché la PCR è molto sensibile a certi componenti presenti nel vino rosso, per lo più responsabili di falsi negativi. Tuttavia, in altri casi, l’analisi PCR provoca anche falsi positivi per il viticoltore. Diamo un’occhiata alle ragioni dei falsi negativi.
I falsi negativi della Pcr sono un grande handicap per l'analisi dei Bretts vitali nel vino.
Polifenoli, tannini e altre molecole nel vino rosso inibiscono la PCR.
Il catione Mg++ è un cofattore molto importante utilizzato nei kit PCR di Brett per innescare l’attività enzimatica della Taq DNA polimerasi, che a sua volta aumenta la quantità di DNA amplificato.
Se il cofattore Mg++ si lega in modo non specifico a diverse molecole del vino, non sarà più disponibile per la replicazione del DNA, e l’azione della polimerasi sarà ridotta o inesistente. Il numero di Bretts apparirà insignificante quando in realtà sta crescendo rapidamente!
Il vino è una matrice particolarmente difficile da analizzare tramite PCR. Questo perché il vino inibisce l’azione della polimerasi, e alcune delle sue molecole si legano al DNA bersaglio. L’enzima polimerasi utilizzato non può legarsi al DNA per replicare i filamenti.
Alcuni polifenoli sono noti per legarsi al DNA o addirittura per intercalare tra le coppie di basi del DNA formando o complessando con il DNA, come il Resveratrolo; oltre ai polifenoli, altre sostanze nel vino come proteine e acidi organici sono note per inibire l’analisi PCR di Bretts
Le diverse inibizioni della Pcr di Bretts che innescano falsi negativi.
Inibizione dei primers del DNA
In alto a sinistra: la denaturazione del DNA dei Bretts si separa e se non ci sono sostanze inibitrici come nel grafico 1 e 2 sopra, i primer del DNA corrispondono alla sequenza del DNA dei Bretts mirata. Ma se il vino da testare contiene molecole inibitrici che si legano alle aree mirate dai primer, la PCR è inibita.
Qualunque sia il metodo di quantificazione del DNA replicato, sia mediante etichettatura fluorescente dei filamenti di DNA o rivelando il DNA mediante un test colorimetrico su una striscia, il segnale rilevato rimarrà debole o addirittura inesistente, se la replicazione del DNA da parte della polimerasi è stata inibita dalle sostanze inibitrici presenti nel vino, il che è molto frequente.
Questa inibizione della PCR farà credere all’enologo che nessun Brett si sta sviluppando quando in realtà i Brett si stanno moltiplicando.
Non è quindi sorprendente che prove comparative di analisi PCR inter-laboratorio pubblicate in Francia sulla rivista scientifica di enologia Oeno One (Vol 50, N°4, 2016) abbiano mostrato risultati che variano di un fattore 100 o più tra due laboratori per lo stesso campione.
Ma cosa dicono gli scienziati? Ci sono stati test comparativi per valutare l’affidabilità dei test PCR per l’analisi di Bretts?
Uno studio comparativo mostra l'inaffidabilità della PCR per Bretts.
Una conclusione sui risultati rivelatori della PCR di Bretts...
La conclusione di questi test comparativi interlaboratorio è particolarmente interessante. Vedi qui un estratto da questa conclusione (tradotto qui in italiano) “.. il nostro studio evidenzia che i kit commerciali per la quantificazione di B. bruxellensis hanno diversi rendimenti di estrazione che portano a risultati di quantificazione differenti. Gli inconvenienti dei metodi sopra descritti potrebbero influire negativamente sulla decisione di un produttore di vino e portare a deterioramento del vino a causa di sovra o sottostima “.
A causa di falsi postivi e falsi negativi innescati da questi metodi, un grande laboratorio enologico francese che serviva più di 300 cooperative vinicole e 1500 singoli enologi, smise di utilizzare la citometria a flusso e la PCR e per lo screening Bretts nel vino, e ritornò alla classica incubazione di 7 giorni con piastra di agar Brett metodo di conteggio.
Ma cosa è responsabile dei falsi positivi, e di una sovrastima del numero di Bretts vitali in un’analisi PCR del vino?
Perché l'analisi PCR di Bretts dà anche falsi positivi?
Falsi allarmi PCR innescati da Brettanomyces morti …
Le tecnologie PCR in tempo reale possono sembrare molto sensibili, ma innescare falsi positivi replicando il DNA di lievito Brettanomyces morto, poiché molte cellule morte di Brett mantengono la loro membrana e il loro DNA intracellulare non viene rimosso mediante filtrazione.
Oltre al DNA libero. tendono a legarsi alle particelle sui filtri. Pertanto i rapidi metodi di PCR replicheranno anche il DNA di Brett morto insieme al DNA di cellule di lievito vivo Brett ed è spesso responsabile di falsi positivi.
A causa di falsi postivi e falsi negativi innescati da questi metodi, un grande laboratorio enologico francese che serviva più di 300 cooperative vinicole e 1500 singoli enologi, smise di utilizzare la citometria a flusso e la PCR e per lo screening Bretts nel vino, e ritornò alla classica incubazione di 7 giorni con piastra di agar Brett metodo di conteggio.
E l'analisi di Bretts con la citometria a flusso?
La citometria a flusso per il rilevamento del lievito Brett utilizza due metodi:
• Il primo metodo consiste nel quantificare la concentrazione di lievito vitale del vino campionato sopra le fecce di vino, etichettando cellule di lievito vitale. Come lievito vitale hanno la capacità di fendere una molecola che penetra nella loro parete cellulare di lievito. Questa molecola diventa fluorescente quando il lievito ha una sufficiente attività esterasi. Tuttavia i lieviti Brettanomyces possono essere stressati dal biossido di zolfo nel vino. Questo strees ridurrà la loro attività di esterasi. Le cellule di lievito Brett potrebbero non essere sufficientemente fluorescenti per essere distinte dal rumore di fondo del vino rosso fluorescente.
• Il secondo metodo utilizza gli anticorpi Brettanomyces bruxellensis marcati con coloranti fluorescenti. Questi anticorpi si legano alla superficie cellulare di Brettanomyces. Questi anticorpi sono etichettati con particelle fluorescenti. Ciò consente alle cellule di lievito Brettanomyces di essere troppo discriminate rispetto agli altri lieviti. Tuttavia questi anticorpi non sono abbastanza specifici e non prendono di mira tutti i ceppi Brettanomyces bruxellensis, portando a falsi negativi.
La citometria a flusso richiedono importanti investimenti finanziari e costi di manutenzione annuale.
Che ne dite di contare i Bretts con la microscopia a epifluorescenza?
La microscopia con epifluorescenza è difficile e noiosa. Questo perché il lievito Brettanomyces ha molte diverse forme cellulari. Oltre alla microscopia non è abbastanza sensibile per rilevare i livelli di soglia precoce, prima del deterioramento. Il limite di rivelazione richiesto per la microscopia a epifluorescenza spesso raggiunge la soglia critica delle popolazioni di Brett in cui la produzione di etilfenolo è già critica.
Nessun metodo di analisi dei Bretts che possa essere utilizzato sul campo dal viticoltore
Nessuno dei metodi di analisi rapida può essere usato sul campo dal viticoltore, tutti richiedono personale altamente qualificato per eseguire e interpretare i risultati delle analisi. Inoltre, i risultati errati della PCR innescano falsi allarmi o portano il viticoltore a credere che tutto va bene, mentre i Brett si stanno moltiplicando ma lui non lo sa perché il suo vino inibisce l’analisi PCR.
Il viticoltore non può prendere misure correttive immediate per ridurre il numero di Bretts e minimizzare la produzione di derivati fenolici nel suo vino.
Esiste un metodo per analizzare rapidamente i Brettanomyces bruxellensis vitali, evitando i falsi positivi (falso allarme) innescati dai Brett morti, e i falsi negativi causati dall’inibizione della PCR da parte di sostanze inibenti presenti nel vino?
Esiste un metodo rapido che può essere usato sul campo e che non richiede un tecnico di laboratorio esperto? Questo metodo permette di prendere misure correttive per ridurre i Bretts, senza aspettare i risultati dell’agar?
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