Pourquoi l’Atpmétrie classique de 1ère génération et de 2nde génération déclenchent des faux positifs et de faux négatifs lorsqu’il s’agit de détecter les flores levuriennes ou bactériennes d’un échantillon? Quels sont les défis insurmontables, et notamment le manque de fiabilité auxquels sont confrontés les kits d’analyse de bioluminescence de l’ATP utilisés traditionnellement pour l’analyse des surfaces en contrôle d’hygiène et pour la détection des flores totales en microbiologie?
Pour être fiables, les méthodes rapides d’analyse de bioluminescence de l’Atp doivent être capables de surmonter différents défis techniques.
Pour comprendre les défis auxquels sont confrontées les kits classiques d’analyse d’ ATP, il est nécessaire de comprendre le fonctionnement des différents types de kits d’analyse de l’Atp par bioluminescence.
Les méthodes d’analyses classiques de la bioluminescence de l’Atp disponibles sur le marché sont divisés en deux catégories,
Chacune de ces catégories de tests de bioluminescence de l’Atp ont chacune leurs propres limites.
Mais voyons d’abord la différence entre ces deux types de kits d’analyse de bioluminescence de l’ATP, afin de comprendre les défis à relever.
Les kits classiques d'ATP-métrie de 1ère et 2nde génération.
Les kits d’Atpmétrie de première génération font référence à la méthode d’analyse par bioluminescence de l’Atp total où toutes les molécules d’Atp libres ainsi que les molécules d’Atp intracellulaires sont analysées ensemble sans aucune discrimination.
Les kits d’ATPmétrie de seconde génération font référence aux méthodes d’analyses par bioluminescence de l’ATP qui quantifient uniquement l’ATP intracellulaire, ceci sans aucune discrimination du type de cellule, qu’il s’agisse d’une cellule végétale, somatique ou de micro-organismes.
Avant d’examiner les problèmes techniques que les kits d’Atpmétrie de 1ère et 2ème génération ne résolvent pas, il est utile de comprendre l’impact des différentes molécules et cellules des échantillons sur la bioluminescence de l’Atp mesurée.
Quelles molécules & cellules d'échantillon affectent la bioluminescence de l'Atp
Les méthodes classiques de mesure de la bioluminescence de l’ATP (adénosine triphosphate) rencontrent de nombreux problèmes techniques non résolus. Cela rend les résultats de leurs kits d’ATPmétrie peu fiables. Voyons pourquoi.
Les défis irrésolus des kits d'Atpmétrie de 1ère et 2ème génération...
Des subtances inhibitrices responsables de faux négatifs
L'Atp libre déclenche des faux positifs
De nombreuses molécules présentes dans les boissons, et d’autres liquides, si elles ne sont pas éliminées (dioxyde de soufre, ions métalliques, tanins, polyphénols) inhibent la réaction de bioluminescence de l’ATP tel que publié dans des études scientifiques.
L’écouvillonnage recupère en surface des traces de détergents libérées ensuite avec l’extractant dans le tube d’analyse du luminomètre qui contient la luciférine-luficérase.
Ces substances inhibitrices vont donc réduire la réaction de bioluminescence déclenchée par la présence luciférine-luficérase avec l’ATP récupéré.
Alors les valeurs de luminescence détectées par le bioluminomètre seront inférieures à ce qu’elles auraient du être, en raison de cet effet inhibiteur et donnera des résultats faussement négatifs.
Ces faux négatifs feront croire à l’utilisateur que la population microbienne dans l’échantillon est faible ou inexistante, alors que c’est tout le contraire !
Certaines boissons et en particulier la bière peuvent contenir beaucoup d’ATP libre d’origine végétale libérée pendant le brassage par les cellules végétales lysées.
D’autres part, lorsque les levures se multiplient, elles bourgeonnent et produisent des cellules filles. Ces cellules filles se détachent de la cellule mère et libèrent à ce moment crucial d’énormes quantités d’ATP.
Si cet ATP libre n’est pas détruit ou évacué, il est analysé en même temps que l’ATP des micro-organismes, et donne des résultats faussement positifs.
Ces faux positifs suggèrent que l’échantillon analysé contient de nombreux micro-organismes, alors que les valeurs de bioluminescence sont principalement dues à l’ATP libre…
Corrélation ATPmétrie et nbre microorganismes impossible avec les kits de 1ère et 2ème génération
Théoriquement, plus la quantité d’ATP libérée est élevée, plus l’intensité de la bioluminescence de l’ATP en présence de luciférine-luciférase le serait aussi, plus le nombre de micro-organismes viables présents dans l’échantillon le serait aussi.
L' Atpmétrie de 1ère ou 2nde génération n'est pas spécifique.
Dans un mélange de différentes cellules de diverses origines, les méthodes classiques de mesure de la bioluminescence de l’Atp, quelles soient de 1ère ou de 2ème génération n’arrivent pas à discriminer l’Atp microbien de l’ATP d’autres cellules végétales ou somatiques, par exemple lors de prélèvement de surface.
Les réactifs utilisés lysent en général l’ensemble des cellules sans discrimination de types de cellules, et libèrent l’ATP de toutes cellules confondues. C’est particulièrement problématique car certaines cellules non microbiennes contiennent des quantités énormes d’ATP et donc les valeurs de bioluminescence par cet Atp non microbien ne permettra jamais de quantifier la population de microorganismes.
Les kits d'Atpmétrie de 3ème génération relèvent ces défis.
Les kits d’ATP-métrie de troisième génération font référence à une méthode de quantification de l’ATP intracellulaire microbien discriminé de l’ATP libre et de l’ATP des cellules somatiques.
Ce type de test ATP utilise une combinaison de cuvette à fond filtrant avec un agent d’extraction d’ATP des cellules somatiques et un réactif de lyse microbienne.
Cette méthode d’analyse de la bioluminescence de l’ATP a été utilisée avec succès et publié dans de nombreuses études de corrélation entre l’analyse par Atpmétrie et les résultats des cultures sur gélose, pour: l’eau potable, l’eau de piscine, de fluides de coupe, de spores de bacilles, d’analyse de surface, d’air et de carcasses de viande.
Le kit d’analyse de l’Atp de 3ème génération a été initialement désigné kit Profile-1 et inventé par New Horizons Diagnostics Inc. à Baltimore aux Etats Unis. Ce kit a d’abord été utilisé pour détecter les spores de bacilles dans les aérosols biologiques lors de la guerre Tempête du désert en Irak, puis pour l’analyse de l’hygiène de carcasses de viande et pour l’eau potable.
Ce kit permet de concentrer les cellules avec une seringue et un concentrateur de cellules contenant une cuvette-filtre amovible la Filtravette™.
Cette invention Filtravette™ permet de concentrer, de lessiver les substances inhibitrices et l’ATP libre, l’ATP des cellules somatiques contenu dans l’échantillon, de faire différents traitements d’échantillons et de déclencher et quantifier la réaction de bioluminescence de l’Atp, tout ceci dans la même cuvette.
Le kit d’Atpmétrie de 3ème génération concentre les cellules à analyser, libére l’Atp somatique, lessive l’Atp libre et somatique, ajoute la luciférine-luciférase et la mesure la bioluminescence de l’ATP dans la même cuvette-filtre.
Un lessivage des substances inhibitrices efficace
Ici, à droite, deux graphiques montrent l’efficacité du lessivage de la Filtravette avec le réactif de lessivage SRA, d’échantilons liquides contenant différentes concentration d’un détergent TCA et d’eau de Javel (en anglais Bleach) et l’impact sur le signal de bioluminescence de l’ATP avec ou sans lessivage de la Filtravette.
L'atpmétrie de 3ème génération detecte aussi les microorganismes viables non cultivables (VNC).
L’ATP intracellulaire est un excellent marqueur de viabilité des microorganismes viables non cultivables (VNC)1,2,3, car ceux ci produisent toujours de l’ATP pour se maintenir en vie et la teneur en ATP intracellulaire ne semble pas affecté par l’état VNC des microorganismes,4, et est même supérieur comme marqueur que la mesure de l’activité estérase, qui souvent est faible chez les microorganismes viables non cultivables.
De nombreuse études de corrélation avec les kits d'Atpmétrie de 3ème génération.
Le kit d’Atpmétrie de 3ème génération Profile-1, en raison de sa fiabilité et sa résistance aux substances inhibitrices, a fait l’objet de nombreuses études de scientifiques indépendantes. Ces études ont validé la corrélation entre les méthodes de culture sur gélose et les valeurs de bioluminescence de l’Atp dans un échantillon mesuré avec le kit Profile-1.
Selectionnez les études de corrélation publiées en anglais en cliquant sur les différents boutons ci-dessous.
Bibliographie scientifique ATP marqueur des bactéries VNC:
- Beumer R.R., deVries J., Rombouts F.M., Campylobacter jejuni non-culturable coccoid cells, Int. J. Food Microbiol. (1992) 15:153–163.
- Federighi M., Tholozan J.L., Cappelier J.M.,Tissier J.P., Jouve J.L., Evidence of non-coccoid viable but non culturable Campylobacter jejuni cells
in microcosm water by direct viable count, CTC-DAPI double staining, and scanning electron microscopy,
Food Microbiol. (1998) 15:539–550. - Li J., Kolling G.L., Matthews K.R., Chikindas M.L., Cold and carbon dioxide used as multi-hurdle
preservation do not induce appearance of viable but non-culturable Listeria monocytogenes, J. Appl. Microbiol. (2003) 94:48–53 - Toril Lindback, Martin E. Rottenberg, Sylvie M. Roche, Liv Marit RØrvik. The ability to enter into an avirulent viable but non-culturable (VBNC) form is widespread among Listeria monocytogenes isolates from salmon, patients and environment Vet. Res. (2010) 41:08
Cependant, les kits d’ATP-métrie de 3ème génération ont leurs limites, ils ne permettent pas de discriminer sélectivement les micro-organismes d’autres micro-organismes non ciblés.
La gageure des bactéries fixées sur les levures pour les kits d'Atpmétrie de 3ème génération
Autre obstacle non négligeable. Les levures ne peuvent être facilement séparée de toutes les bactéries acétiques et lactiques. Certaines bactéries adhèrent aux cellules des levures et forment des agrégats microbiens.
Il est donc impossible avec les méthodes classiques d’ATPmétrie que celles-ci soient de 1ère ou de 2ème génération de différencier les bactéries des levures, lorsque l’ATP des levures est analysé avec l’ATP bactérien.
C’est une des raisons pour laquelle l’Atpmétrie classique n’est pas utilisée en oenologie sauf pour les contrôles d’hygiène. Une seule cellule de levure contient autant d’ATP que 100 cellules bactériennes viables.
D’autre part des populations importantes de bactéries lactiques (10 puissance 7/ml) se trouvent dans le vin d’élevage. Ces bactéries faussent les résultats si l’on veut connaître le nombre de levures viables.
Cela signifie-t-il qu’il n’y a pas de solution à ces défis techniques ? Au contraire, une technologie a trouvé la solution : l’ATPmétrie sélective rapide discriminant les levures de certaines bactéries.
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