Schnelle Atp-Biolumineszenzmethoden müssen verschiedene technische Herausforderungen meistern, um zuverlässig zu sein.
Um die technischen Herausforderungen zu verstehen, mit denen herkömmliche Atp-Messmethoden konfrontiert sind, muss man wissen, dass es verschiedene Arten von Atp-Biolumineszenz-Assays gibt.
Klassische Methoden die auf dem Markt erhältlichen Atp-Biolumineszenz-Testkits werden in zwei verschiedene Kategorien geteilt,
- ATP-Testkits der 1. Generation
- ATP-Testkits der 2. Generation
Jeder dieser ATP-Biolumineszenz-Test hat seine eigenen Einschränkungen.
Aber lassen Sie uns zunächst den Unterschied zwischen diesen beiden verschiedenen Arten von ATP-Biolumineszenz-Testkits betrachten, um die damit verbundenen Probleme zu verstehen.
Klassische ATP-Biolumineszenz-Testkits der 1. und 2. Generation
Die Atp-Biolumineszenz der ersten Generation bezieht sich auf die Gesamt-Atp-Biolumineszenzmethode, bei der freie Atp-Moleküle und intrazelluläre Atp-Moleküle ohne Unterscheidung zusammen analysiert werden.
Die Atp-Biolumineszenz der zweiten Generation bezieht sich auf ATP-Nachweissmethoden, die nur intrazelluläres ATP quantifizieren, ohne Unterscheidung des Zelltyps, gleichgültig ob es sich um eine Pflanzenzelle, eine somatische Zelle oder eine Zelle eines Mikroorganismus handelt.
Bevor die Probleme untersucht werden, die die Atp-Biolumineszenz-Assays der 1. und 2. Generation nicht lösen können, ist es nützlich zu verstehen, welche Auswirkungen verschiedene Moleküle und Zellen in den Proben auf die gemessene Atp-Biolumineszenz haben.
Welche Moleküle & Zellen in der Probe die Atp-Biolumineszenz beeinflussen?
Die klassischen ATP-Test (Adenosintriphosphat-Biolumineszenzmethoden) stoßen auf viele ungelöste technische Probleme. Deshalb sind die Ergebnisse ihrer ATP-Tests unzuverlässig. Lassen Sie uns herausfinden, warum.
Ungelöste Probleme der 1. und 2. Generation von Atp-Test.
Die Hemmung von Wirkstoffen führt zu falsch-negativen Ergebnissen
Freies ATP führt zu falsch-positiven Ergebnissen
In Getränken und anderen Flüssigkeiten vorhandene Moleküle (Schwefeldioxid, Metallionen, Gerbstoffe, Polyphenole) hemmen die Atpbiolumineszenz-Reaktion, wenn sie nicht entfernt werden.
Beim Abstreifen von Tupfproben sammeln sich auf der Oberfläche Spuren von Detergenzien, die in das Teströhrchen des Luminometers freigesetzt und an die Luziferin/Luziferase abgegeben werden.
Infolgedessen stören diese Reizstoffe die Luciferin-Luciferase-Reaktion.
Dies kann sogar so weit gehen, dass die mit dem Atp-Messgerät oder Luminometer gemessene Atp-Biolumineszenzreaktion erheblich reduziert wird. Die niedrigeren Lumineszenzwerte, die aufgrund dieses Quenching-Effekts gemessen werden, führen zu falsch negativen Ergebnissen.
Diese falsch-negativen Messergebnisse lassen den Anwender glauben, dass die mikrobielle Belastung in der Probe gering oder nicht vorhanden ist, obwohl dies nicht stimmt!
Getränke wie Bier enthalten viel freies ATP pflanzlichen Ursprungs, das beim Brauen freigesetzt wird.
Wenn sich Hefen vermehren, bilden sie Knospen und Tochterzellen. Diese Tochterzellen lösen sich von der Mutterzelle ab und setzen große Mengen an ATP frei.
Wenn dieses freie ATP zusammen mit Mikroorganismen analysiert wird, führt dies zu falsch positiven Ergebnissen.
Diese falsch positiven Ergebnisse deuten darauf hin, dass die analysierte Probe viele Mikroorganismen enthält, während die Biolumineszenzwerte hauptsächlich auf freies ATP zurückzuführen sind.
Korrelation zwischen ATP-Messung und Keimbelastung mit ATP-Testkits der ersten und zweiten Generation nicht möglich.
Rein theoretisch würde die Intensität der Biolumineszenz von ATP in Präsenz von Luciferin-Luciferase umso höher sein, je mehr ATP freigesetzt wird und je mehr lebensfähige Mikroorganismen in der Probe vorhanden sind.
ATP, das mit ATP-Kits der 1. oder 2. Generation gemessen wird, ist nicht spezifisch.
In einer Mischung aus verschiedenen Zellen unterschiedlicher Herkunft können die herkömmlichen Methoden zur Messung der Biolumineszenz von Atp, ob der ersten oder der zweiten Generation, nicht zwischen mikrobiellem Atp und ATP aus anderen pflanzlichen oder somatischen Zellen unterscheiden, z. B. bei Oberflächenproben.
Die verwendeten Reagenzien lysieren in der Regel alle Zellen ohne Unterscheidung der Zelltypen und setzen das ATP aus allen Zellen zusammen frei. Dies ist besonders problematisch, da einige nicht-mikrobielle Zellen enorme Mengen an ATP enthalten und daher die Werte der Biolumineszenz durch dieses nicht-mikrobielle Atp niemals eine Quantifizierung der Mikroorganismenpopulation ermöglichen werden.
ATP-Biolumineszenz-Kit der 3. Generation löst diese Probleme
ATP-Testkits der dritten Generation beziehen sich auf eine Methode zur Quantifizierung von mikrobiellem intrazellulärem ATP, das von ATP aus somatischen Zellen unterschieden wird.
Diese Methode verwendet eine Filter-Küvetten-Kombination mit einem spezifischen somatischen Freisetzungsmittel und einem mikrobiellen Lysereagenz und wurde erfolgreich für Wasser-, Oberflächen-, Luft- und Fleischschlachtkörper-ATP-Biolumineszenz-Korrelationsstudien verwendet und veröffentlicht.
Der Atp-Biolumineszenz-Assay der 3. Generation hieß ursprünglich Profile-1 und wurde von New Horizons Diagnostics Inc. in Baltimore entwickelt.
Profile-1 ermöglicht die Konzentration von Zellen mit einer Spritze und einem Zellkonzentrator, der einen abnehmbaren Küvettenfilter, die Filtravette™, enthält.
Diese Filtravette erlaubt es, Zellen zu konzentrieren, hemmende Substanzen auszuspülen, verschiedene Probenbehandlungen durchzuführen und die Atp-Biolumineszenzreaktion in derselben Küvette auszulösen und zu quantifizieren.
Die beiden Diagramme auf der rechten Seite zeigen das Atp-Biolumineszenzsignal mit Filtravette, um TCA-Extraktionsmittel und Bleichmittel zu spülen, sowie den Quenching-Effekt auf die ATP-Biolumineszenzwerte mit oder ohne Spülung mit somatischen Freisetzungsmitteln.
Das Atp-Test “Profile-1” der 3. Generation wurde aufgrund seiner Zuverlässigkeit und seiner Resistenz gegenüber Quenching-Substanzen sehr häufig in zahlreichen unabhängigen Korrelationsstudien veröffentlicht. In diesen Studien wurde die Korrelation zwischen Plattenzählmethoden und Atp-Biolumineszenzwerten in einer mit Profile-1 nachgewiesenen Probe validiert.
Zahlreiche Korrelationsstudien mit Atp-Testkits der 3. Generation
Wählen Sie die veröffentlichten Englische Korrelationsstudien zwischen ATPNachweiss und KBE Anzahl aus, indem Sie auf die verschiedenen Buttons klicken.
ATP-Tests der 3. Generation haben jedoch ihre Grenzen, da sie Mikroorganismen nicht selektiv von anderen, nicht zielgerichteten Mikroorganismen unterscheiden können.
Grenzen des ATP-Test der 3. Generation: keine selektive Unterscheidung zwischen Hefen und Bakterien durchführbar.
Daher können konventionelle ATP-Messmethoden, ob Atp-Biolumineszenzmethoden der 1., 2. oder 3. Generation, Hefen nicht von Bakterien unterscheiden, wenn Hefe-ATP zusammen mit bakteriellem ATP analysiert wird.
Hefen bilden sehr oft Cluster mit Bakterien, die sich nur sehr schwer, wenn überhaupt, durch Filtration oder Zentrifugation trennen lassen.
Dies ist einer der Gründe, warum diese klassischen Atp-Biolumineszenzmethoden in der Önologie nur zur Hygienekontrolle eingesetzt werden, da eine einzige Hefezelle so viel ATP enthält wie 100 lebensfähige Bakterienzellen.
Andererseits finden sich während der Weinalterung bedeutende Populationen von Milchsäurebakterien (10 exponentielle 7 / ml). Diese Bakterien können die Biolumineszenz-Ergebnisse überlagern, so dass es unmöglich ist, die Anzahl der lebensfähigen Hefen in der Probe zu bestimmen.
Heißt das, dass es keine Lösung für diese ungelösten Probleme gibt?
Es gibt in der Tat eine Lösung für: Schnelle selektive Atp-Biolumineszenz zur Unterscheidung von Hefen und bestimmten Bakterien.
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